Etapa 1. Rastreamento da TB
A primeira etapa é o rastreamento da TB, conforme descrito na Etapa 1 da prova tuberculínica (PT) ou teste cutâneo baseado em antígenos de Mycobacterium tuberculosis (TBST) no Anexo 1.
Etapa 2. Explicação da aplicação do QFT-Plus
É importante assegurar que o paciente compreenda os procedimentos e dê seu consentimento. O paciente deve receber informações sobre as consequências de fazer o teste e deve entender os resultados e o que precisará fazer após receber esses resultados.
Etapa 3. Coleta e manuseio adequado do sangue (até a incubação)
Há várias opções de coleta de sangue para o QFT-Plus (1).
Opção A: coleta direta em tubos de coleta de sangue QFT-Plus
Uma opção é coletar o sangue diretamente nos tubos QFT-Plus:
- Os tubos devem estar adequadamente rotulados; cada tubo deve ser identificável por seu rótulo depois da retirada da tampa, e a hora e a data da coleta de sangue devem estar incluídas no rótulo. Também é importante certificar-se de que os tubos sejam mantidos em temperatura ambiente (17 a 25 °C) no momento da coleta de sangue.
- Um flebotomista capacitado deve coletar 1 mL de sangue por punção venosa diretamente em cada um dos tubos de coleta de sangue de cada paciente, assegurando que o volume correto seja coletado; a faixa validada é de 0,8 mL a 1,2 mL (Fig. A2.1.1). O enchimento insuficiente ou excessivo do tubo com uma quantidade fora da faixa validada pode causar resultados incorretos.
Fig. A2.1.1. Coleta direta em tubos de coleta de sangue QFT-Plus
Assista ao vídeo em: https://www.quantiferon.com/us/products/quantiferon-tb-gold-plus-us/laboratory-resources/training-videos-labs/
- Após o preenchimento dos tubos, eles devem ser imediatamente agitados 10 vezes, com firmeza suficiente para assegurar que toda a superfície interna do tubo seja revestida com sangue a fim de dissolver os antígenos nas paredes do tubo. Deve-se evitar agitar com muita força, pois isso pode romper o gel e provocar resultados incorretos.
- Após a agitação, os tubos devem ser transferidos para uma incubadora ajustada a 37 °C (±1 °C) o mais rápido possível (e dentro de 16 horas após a coleta). Se os tubos não forem incubados imediatamente após a coleta de sangue e a agitação, os tubos devem ser invertidos 10 vezes, a fim de misturá-los, antes de serem incubados a 37 °C.
- Os tubos de coleta de sangue QFT-Plus devem ser incubados na posição vertical a 37 °C (±1 °C) por 16 a 24 horas. A incubadora não precisa de CO2 ou umidificação. Esse processo é mostrado na Fig. A2.1.2.
Fig. A2.1.2. Processo para coleta direta em tubos de coleta de sangue QFT-Plus
Opção B: coleta de sangue em um único tubo de heparina de lítio seguida de transferência para tubos de coleta de sangue QFT-Plus
Outra opção é que o sangue seja coletado em um único tubo de coleta de sangue contendo heparina de lítio como anticoagulante e, em seguida, transferido para um tubo QFT-Plus:
- Apenas a heparina de lítio deve ser usada como anticoagulante sanguíneo, pois outros anticoagulantes podem interferir no ensaio.
- Os tubos devem ser rotulados adequadamente, como na opção de extração direta descrita acima.
- Um flebotomista capacitado deve preencher um tubo de coleta de sangue com heparina de lítio (volume mínimo de 5 mL) (Fig. A2.1.3) e, em seguida, inverter o tubo várias vezes para dissolver a heparina.
Fig. A2.1.3. Coleta de sangue em um único tubo de heparina de lítio
Assista ao vídeo em: https://www.quantiferon.com/us/products/quantiferon-tb-gold-plus-us/laboratory-resources/training-videos-labs/
Há diferentes opções de tempo de espera e temperatura para os tubos de heparina de lítio antes da transferência para os tubos QFT-Plus para incubação.
Opção A: armazenamento em temperatura ambiente e manuseio do tubo de heparina de lítio
- Nessa opção, o sangue coletado no tubo de heparina de lítio é mantido em temperatura ambiente (17 a 25 °C) por, no máximo, 12 horas a partir do momento da coleta antes de ser transferido para um tubo QFT-Plus e, em seguida, incubado (Fig. A2.1.4).
Fig. A2.1.4. Coleta de sangue no tubo de heparina de lítio e manutenção em temperatura ambiente
Opção B: armazenamento refrigerado e manuseio do tubo de heparina de lítio
- Nessa opção, o sangue coletado no tubo de heparina de lítio pode ser mantido em temperatura ambiente (17 a 25 °C) por até 3 horas após a coleta e, em seguida, refrigerado (2 a 8 °C) por até 48 horas.
- Após a refrigeração, o tubo de heparina de lítio deve ser equilibrado em temperatura ambiente (17 a 25 °C) antes da transferência da amostra para os tubos de coleta de sangue QFT-Plus.
- Após a transferência da amostra, os tubos QFT-Plus devem ser colocados em uma incubadora a 37 °C dentro de 2 horas.
Se houver atraso entre a transferência para os tubos QFT-Plus e a incubação a 37 °C, os tubos devem ser misturados 10 vezes (por inversão) antes de serem incubados a 37 °C. O tempo total desde a coleta até a incubação nos tubos QFT-Plus não deve exceder 53 horas (Fig. A2.1.5).
Fig. A2.1.5. Coleta de sangue no tubo de heparina de lítio e manutenção a 2 a 8 °C
- Transferência da amostra de sangue de um tubo de heparina de lítio para tubos QFT-Plus:
- Cada tubo QFT-Plus deve estar adequadamente rotulado, de forma que cada um dos quatro tubos (Nil, mitógeno, TB1 e TB2) possa ser identificado por seu rótulo ou por outros meios quando a tampa for retirada.
- A amostra deve ser misturada uniformemente por inversão suave antes de ser distribuída nos tubos QFT-Plus. Além disso, a distribuição deve ser realizada de forma asséptica, seguindo procedimentos de segurança adequados para retirar as tampas dos quatro tubos de coleta de sangue QFT-Plus e adicionar 1 mL de sangue a cada tubo.
- As tampas dos tubos devem ser recolocadas com firmeza e o conteúdo deve ser misturado conforme descrito a seguir.
- Mistura das amostras:
- Imediatamente após serem enchidos, os tubos de coleta de sangue QFT-Plus devem ser agitados 10 vezes, com firmeza suficiente para assegurar que toda a superfície interna do tubo seja revestida com sangue a fim de dissolver os antígenos nas paredes do tubo.
- Deve-se evitar agitar com muita força, pois isso pode romper o gel e provocar resultados aberrantes.
- Após a mistura, os tubos devem ser transferidos para uma incubadora a 37 °C ± 1 °C dentro de 2 horas. Se houver atraso entre a transferência para os tubos QFT-Plus e a incubação a 37 °C, os tubos devem ser misturados 10 vezes (por inversão) antes de serem incubados a 37 °C.
- Os tubos QFT-Plus devem ser incubados na posição vertical a 37 °C ±1 °C por 16 a 24 horas. A incubadora não requer CO2 nem umidificação.
Etapa 4. Centrifugação
Após a incubação, os tubos são centrifugados a uma força centrífuga relativa (FCR) de 2000 a 3000 × g. Em seguida, o sobrenadante é extraído (o fabricante observa que essa etapa pode ser realizada sem centrifugação, mas é preciso tomar cuidado para não aspirar eritrócitos).
Etapa 5. Ensaio de imunoadsorção enzimática
O ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA, na sigla em inglês) envolve várias etapas de mistura de reagentes com o sobrenadante. Essa mistura é incubada por 2 horas, em seguida a placa é lavada, são adicionados mais reagentes e a placa é incubada por mais 30 minutos. Por fim, a concentração de interferon-gama é estimada a partir da densidade óptica, medida por meio de um leitor de densidade óptica.
Materiais e insumos fornecidos pelo fabricante
A bula do produto (1) explica que há dois componentes fornecidos pelo fabricante: tubos de coleta de sangue (Nil, mitógeno, TB1 e TB2) e reagentes do kit ELISA. O QFT-Plus usa dois tipos de tubos de coleta:
- Tubos de coleta de sangue QFT-Plus, para uso entre o nível do mar e 810 m: tubos vazios (tampa cinza com anel branco), tubos mitógeno (tampa roxa com anel branco), tubos TB1 (tampa verde com anel branco) e tubos TB2 (tampa amarela com anel branco); e
- tubos de coleta de sangue QFT-Plus de alta altitude (HA, na sigla em inglês), para uso entre 1020 m e 1875 m: tubos HA vazios (tampa cinza com anel amarelo), tubos HA mitógeno (tampa roxa com anel amarelo), tubos HA TB1 (tampa verde com anel amarelo) e tubos HA TB2 (tampa amarela com anel amarelo).
Os tubos QFT-Plus devem ser armazenados a 4 a 25 °C. Os reagentes do kit ELISA devem ser refrigerados, mas não congelados, e a solução de substrato enzimático deve ficar sempre protegida da luz solar direta. Outros materiais necessários, mas não fornecidos, estão listados abaixo. Todos os instrumentos usados no procedimento devem ser calibrados de acordo com as recomendações do fabricante.
Equipamentos de laboratório necessários
Os seguintes equipamentos são necessários para o QFT-Plus:
- Incubadora de 37 °C ± 1 °C (com ou sem CO2);
- centrífuga capaz de centrifugar os tubos de sangue pelo menos até uma FCR de 3000 (g);
- agitador de microplacas com capacidade para velocidades de 500 a 1000 rpm;
- lavadora de microplacas (para segurança no manuseio de amostras de plasma, recomenda-se uma lavadora automatizada);
- leitor de microplacas equipado com filtro de 450 nm e filtro de referência de 620 a 650 nm;
- agitador vórtex de velocidade variável;
- cronômetro;
- proveta (1 L ou 2 L); e
- reservatórios de reagentes.
Insumos de laboratório necessários
Os seguintes insumos são necessários para o QFT-Plus:
- pipetas de volume variável calibradas para o fornecimento de 10 μL a 1000 μL, com ponteiras descartáveis;
- pipeta multicanal calibrada para o fornecimento de 50 μL a 100 μL, com ponteiras descartáveis;
- água desionizada ou destilada, 2 L; e
- opcional: microtubos de 1 mL com tampa em racks de 96 poços ou microplacas não revestidas com lacres plásticos para armazenamento de plasma (22 amostras de pacientes por rack ou placa).
Pessoal necessário
Para a coleta de sangue, inicialmente é necessário um flebotomista, que pode ser enfermeiro, técnico de laboratório, médico ou outro profissional de saúde.
Se o sangue for coletado diretamente no tubo QFT-Plus, o manuseio inicial é mínimo, pois os tubos são colocados diretamente na incubadora.
Após a incubação, a equipe que realiza o QFT-Plus deve ser composta por técnicos de laboratório qualificados e capacitados em técnicas ELISA. É necessário um tempo substancial da equipe para a centrifugação, pipetagem e mistura dos reagentes e amostras; segunda incubação; manuseio, lavagem e mistura adicionais; terceira incubação; e, finalmente, a medição do ELISA (que também requer a construção de uma curva padrão).
Capacitação, monitoramento e controle de qualidade
A equipe precisa receber capacitação inicial e supervisão, monitoramento e avaliação contínuos para o CQ (consulte o Capítulo 4). A acurácia dos resultados dos testes depende da construção de uma curva padrão precisa para o ELISA; portanto, antes que os resultados das amostras de teste possam ser interpretados, é preciso examinar os resultados dos padrões.
Precauções
Os técnicos de laboratório devem sempre usar equipamentos de proteção individual (EPI). O QFT-Plus destina-se apenas ao uso em diagnóstico in vitro. A não observância das instruções do fabricante pode acarretar uma interpretação incorreta dos resultados.
Interpretação do QFT-Plus
O fabricante recomenda que os resultados do QFT-Plus sejam interpretados com base nas concentrações relativas de interferon-gama nos controles positivo e negativo e nos tubos de antígeno de TB (1). As concentrações são calculadas com base na densidade óptica medida simultaneamente em poços com concentrações conhecidas de interferon-gama a partir de diluições de uma solução padrão. Embora os resultados sejam quantitativos, o fabricante recomenda que sejam informados resultados qualitativos ao provedor (ou seja, positivo, negativo ou indeterminado), e que seja solicitada a aprovação dos órgãos reguladores para a apresentação de relatórios qualitativos (Tabela A2.1.1 e Fig. A2.1.6).
Tabela A2.1.1. Interpretação dos resultados do teste QFT-Plus
Fig. A2.1.6. Interpretação do QFT-Plus
