OpiniãoOs procedimentos para a coleta de amostras de sangue são semelhantes aos do QFT-Plus, exceto pelo fato de não se recomendar a coleta direta de sangue nos tubos de incubação. Em vez disso, as amostras de sangue são coletadas em tubos de heparina de lítio e depois transferidas para os tubos N, T e P. Um mililitro de amostra de sangue total é transferido para cada um dos tubos de ensaio. Em seguida, esses tubos são colocados diretamente em uma incubadora a 37 °C ± 1 °C dentro de 2 horas e incubados durante 20 a 24 horas. Essas etapas são detalhadas abaixo (3) e mostradas na Fig. A2.2.1 (até a incubação) e na Fig. A2.2.2 (após a incubação).
Etapa 1. Coleta da amostra
- Cada tubo deve estar adequadamente rotulado.
- Para cada paciente, deve-se coletar sangue total em um tubo de heparina de lítio por punção venosa, e o volume coletado deve ser de pelo menos 4 mL. O tubo deve ser bem agitado; em seguida, pode ser armazenado a 20 a 27 °C por até 16 horas antes da etapa de distribuição da amostra.
Etapa 2. Distribuição da amostra
- Cada tubo deve estar adequadamente rotulado.
- O tubo de heparina de lítio deve ser suavemente invertido três a cinco vezes para misturar as amostras.
- Em seguida, 1 mL da amostra de sangue total deve ser inserido em cada tubo (N, T e P).
- Os tubos N, T e P devem ser invertidos suavemente três a cinco vezes para misturar as amostras.
Etapa 3. Incubação
- Imediatamente após a mistura, os tubos N, T e P devem ser colocados em uma incubadora a 37 °C.
- Os tubos devem ser incubados na posição vertical por 22 ± 2 horas.
Etapa 4. Centrifugação
Após a incubação, todos os tubos devem ser centrifugados durante 10 minutos a 3000 a 5000 rpm; em seguida, o sobrenadante deve ser aspirado.
Fig. A2.2.1. Fluxo de trabalho do WANTAI TB-IGRA: preparação e incubação das amostras
Etapa 5. ELISA
Para o ELISA, 20 mL de um tampão de diluição de amostra são adicionados aos poços da microplaca, exceto o poço do branco. Adicionar 50 mL da amostra (sobrenadante) mais 50 mL da solução padrão nos respectivos poços, exceto no poço do branco, e mistura batendo suavemente na placa. Em seguida, incubar por 60 minutos e adicionar o reagente de peroxidase de rábano. Todos os poços são incubados durante mais 60 minutos. Depois disso, os poços são lavados pelo menos cinco vezes, de preferência com uma lavadora de placas automatizada. Por fim, são adicionadas o corante A e o corante B e todos os poços são incubados durante mais 15 minutos. Um reagente final é adicionado para interromper a ação colorimétrica e, em seguida, a densidade óptica é lida por meio de um leitor de microplacas ELISA.
Fig. A2.2.2. Fluxo de trabalho do WANTAI TB-IGRA: procedimentos de teste após a incubação
Materiais e insumos fornecidos pelo fabricante
O fabricante fornece a placa ELISA, os reagentes de teste (tubos N, T e P) e os padrões. Os componentes do kit devem ser armazenados em um refrigerador a 2 a 8 °C. Para assegurar o máximo rendimento desse kit de TB-IGRA, os reagentes devem ser protegidos contra contaminação por microrganismos ou produtos químicos durante o armazenamento. Outros materiais necessários, mas não fornecidos, estão listados abaixo.
Equipamentos de laboratório necessários
Os seguintes equipamentos de laboratório são necessários para o WANTAI TB-IGRA:
- incubadora seca ou banho-maria, 37 °C + 0,5 °C;
- microagitador para dissolver e misturar o conjugado com as amostras;
- leitor de placas de micropoços, comprimento de onda único de 450 nm ou comprimento de onda duplo de 450 nm e 630 nm;
- sistema de aspiração e lavagem de micropoços;
- cronômetro; e
- recipientes apropriados para resíduos potencialmente contaminados.
Materiais de laboratório necessários
Os seguintes materiais de laboratório são necessários para o WANTAI TB-IGRA:
- água recém-destilada ou desionizada;
- luvas descartáveis;
- cubas descartáveis em forma de V;
- sistema de distribuição ou pipeta (simples ou multicanal) com ponteiras descartáveis; e
- lenço absorvente ou toalha limpa.
Pessoal necessário
Para a coleta de sangue, é necessário um flebotomista, que pode ser enfermeiro, técnico de laboratório, médico ou outro profissional de saúde.
No laboratório, as etapas após a incubação são semelhantes às do QFT-Plus, embora possam ser um pouco mais trabalhosas. É necessário um tempo substancial da equipe para a centrifugação, pipetagem e mistura dos reagentes e amostras; segunda incubação; manuseio, lavagem e mistura adicionais; terceira incubação; e, finalmente, a medição do ELISA (que também requer a construção de uma curva padrão).
Capacitação, supervisão e controle de qualidade
O pessoal encarregado desse ensaio necessita de capacitação inicial e monitoramento e avaliação contínuos para o controle de qualidade (CQ). A acurácia dos resultados do teste depende da construção de uma curva padrão precisa. Portanto, antes que os resultados das amostras de teste possam ser interpretados, é preciso examinar os resultados dos padrões.
Precauções
Os técnicos de laboratório devem sempre usar EPI (incluindo jaleco de laboratório, luvas descartáveis e óculos de proteção) ao trabalhar com os reagentes químicos necessários para esse teste (3). O WANTAI TB-IGRA destina-se apenas ao uso in vitro. A não observância das instruções do fabricante pode acarretar a interpretação incorreta dos resultados.
Interpretação do WANTAI TB-IGRA
A interpretação do resultado do teste baseia-se na calibração da curva padrão com o uso de uma série de soluções padrão de interferon-gama diluídas e, em seguida, plotando-se valores dos poços positivo, negativo e de antígeno de TB em uma curva padrão. O fabricante recomenda a adoção dos critérios mostrados na Tabela A2.2.1 ao interpretar os resultados do WANTAI TB-IGRA (3).
Tabela A2.2.1. Interpretação dos resultados do teste WANTAI TB-IGRA
